さらに「茉莉花」と「時計草」が、老化により減少するメラトニンの合成酵素と受容体を回復

介して細胞内 cAMP 濃度を減少させ、 メラトニン合成の律速酵素であるセロトニン N-アセチル基転移酵 ..

演者：笠原 和起 博士
理化学研究所 脳科学総合研究センター 精神疾患動態研究チーム 副チームリーダー
演題：実験用マウスは飼育舎の中で独自の進化を遂げてメラトニンを作らないようになった
日時：平成22年6月4日（金）15：00〜16：30
場所：東京大学理学部3号館4階416号室

メラトニンは松果体において生合成されるホルモンであり、概日リズムや季節性繁殖応答の調節にかかわっていると考えられている。不思議なことに、実験用マウスの多くの系統がメラトニンを合成しない。さらに奇妙なことに、メラトニン合成系の最終酵素HIOMT（hydroxyindole -methyltransferase）をコードする遺伝子が、ゲノム解読プロジェクトの完了宣言後でもマウスからは見つかっていなかった。我々は、ラットHIOMTの配列をヒントに、メラトニンを作るマウス系統C3H/Heから cDNAをクローニングすることに成功した。メラトニンを作れないC57BL/6系統にも遺伝子は存在し、アミノ酸置換を伴う点変異が2ヶ所存在していた。どちらの変異とも、酵素の発現を強く抑制した。FISH解析の結果、遺伝子が性染色体の偽常染色体領域（PAR）に存在することを見出した。PARは組換え頻度が平均的な染色体領域よりも約100倍高いため、変異が生じやすい。このことが、実験用マウスの多くがHIOMT活性を失った原因のゲノム科学的な説明になろう。の変異が飼育舎内のコロニーに固定された生理学的な（飼育者にとっては経営学的な）要因について調べたところ、メラトニンが作れないマウスでは精巣の発達が早くなることがわかった。数多くの系統の遺伝子を調べた結果からも、の変異の固定が偶然のドリフトに起因する可能性は低く、次世代を早く誕生させる独自の進化が人間によって長年飼育された過程に起きたと推測された。

Kasahara T, Abe K, Mekada K, Yoshiki A, Kato T. (2010) Genetic variation of melatonin productivity in laboratory mice under domestication. PNAS 107, 6412-6417.

世話人：理学系研究科 深田 吉孝

以上よりラット卵母細胞にメラトニン合成酵素の 1つであるAANAT

1 ng/dl で卵割した受精卵のその後の胚発生率が高くなる傾向を示しました（表１）。
②血中メラトニン濃度と採卵成績（正常卵率，変性卵率，未受精卵率）との間に相関は認められませんでした。
③メラトニン経口投与では投与後1時間後をピークに血中メラトニン濃度は上昇し，その後低下しました。採卵成績についてはメラトニンを投与した場合に，正常卵率が有意に上昇したことから，メラトニンの経口投与により卵品質が改善される可能性が示されました（表２）。
④ ASMT およびMTNR1Aは卵母細胞および卵丘細胞で，MTNR1Bは卵母細胞のみで発現していました。また，卵母細胞及び卵丘細胞でのASMTの発現について日齢と負の相関が認められたことから，卵巣ではウシの 老化によりメラトニン合成量が減少する可能性が示されました。

鈴木信雄教授と服部淳彦教授はこれまでに，骨のモデルとしてキンギョのウロコ（図1）を用いて，概日リズムを調節するホルモンであるメラトニンが破骨細胞（骨を溶かす細胞）の活性を抑制することを初めて見いだしています。そこで，重力のない宇宙において宇宙飛行士に引き起こされる破骨細胞の活性化による骨量の低下に対し，メラトニンが効くと考えられることから，国際宇宙ステーション「きぼう」日本実験棟において宇宙実験を行いました。

メラトニンは必須アミノ酸のトリプトファンを原料（基質）として合成されます（図）。

本研究では，骨芽細胞（骨をつくる細胞）と破骨細胞が共存し，哺乳類の骨と同様のホルモン応答を示すキンギョのウロコを骨モデルとして用いた宇宙実験を実施しました。まず，ウロコの骨芽細胞でメラトニンが作られるとともに，宇宙空間ではメラトニンの合成が低下することを明らかにしました。そこで，メラトニンを添加した培地と無添加の培地でウロコを培養して比較したところ，メラトニン無添加の培地では，わずか3日間の培養でいくつもの破骨細胞が融合して多核化の活性型の破骨細胞になり，その破骨細胞がウロコにある骨質層の溝の幅を広げ，ウロコの骨吸収を促進していることが分かりました。さらにウロコの骨芽細胞において，骨吸収を促進する因子である（※2）の遺伝子発現が上昇し，骨吸収を抑制するホルモンである（※3）の遺伝子発現を抑制することも分かりました。他方，メラトニンを添加した培地で培養すると，ウロコの骨芽細胞におけるRanklの発現が抑制され，カルシトニンの発現が正常に戻ることが明らかになりました。

本研究成果は，メラトニンが宇宙飛行中の宇宙飛行士の骨量減少を防ぐ予防薬として使用できる可能性を示しており，将来，メラトニンが宇宙飛行士の骨量低下の予防・治療薬に活用されることが期待されます。

現が誘導され、メラトニンが生成される可能性が示された。以上の結果より、 妊娠及び加齢によりβ

エクボは酵素などからタンパク質「96種類」だけを選び、耳に聞こえる音で、
「タンパク質のメロディ」を作成しました。

（図下）地上実験において，骨芽細胞におけるメラトニン受容体，メラトニン合成酵素およびカルシトニンの発現を調べた結果，メラトニンはウロコにおけるカルシトニンの産生を促進し，発現が上昇したカルシトニンが破骨細胞を抑制した。
（図上）宇宙実験において，宇宙飛行中の微小重力は，ウロコの破骨細胞における多核化および吸収活性を促進させた。このとき，破骨細胞を活性化させるRANKLの遺伝子発現は上昇し，破骨細胞を抑制するカルシトニンの遺伝子発現は減少した。メラトニンを作用させると，宇宙飛行中のこれらの因子は正常な遺伝子発現レベルを維持し，その結果，微小重力刺激による活性化破骨細胞は抑制された。

胎生期マウスにおけるメラトニン合成酵素の遺伝子発現とメラトニンの発現解析

【用語解説】
※1 メラトニン
メラトニン（N-acetyl-5-methoxytryptamine）は夜間に分泌される，アミンに属するホルモンであり，トリプトファンからセロトニンを経て合成される。合成に関わる重要な酵素として，アリルアルキルアミンN-アセチルトラスフェラーゼ（AANAT）とアセチルセロトニン-O-メチルトランスフェラーゼ（ASMT）が挙げられる。主に松果体から分泌されるが，他の組織においても産生されることが知られており，脊椎動物，無脊椎動物，植物さらにはシアノバクテリアにも存在する，種を越えて保存されたホルモンである。

※2 Rankl
Receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligandの省略形。骨芽細胞で合成され，破骨細胞で発現しているRANK（Receptor activator of nuclear factor kappa-Β）と結合することにより破骨細胞を活性化させ，骨吸収を促進する。本研究では，Ranklの遺伝子発現を解析した。

※3 カルシトニン
哺乳類では甲状腺の傍濾胞細胞，哺乳類以外では鰓後腺から分泌される32アミノ酸残基を有するペプチドホルモンである。主な作用は，破骨細胞の活性を抑制して，骨吸収を抑制する。その結果として，血液中のカルシウム濃度が低下する。

肌を支えるヒアルロン酸やエラスチンなどを産生して元通りに戻し、また状態の良い細胞が増殖して修復する力を維持します。
細胞のはたらきを高めるための植物を研究し、にその効果を見出しました。この植物エキスにより

ニンが作られるとともに，宇宙空間ではメラトニンの合成に関与する合成酵素であるア

ことで、肌のリズムを整え、夜の修復力を高めて、より美しい肌へと導く効果が期待できます。

100％未満）であり、メラトニンは 0.5 μmol/L まで酵素誘導作用を示さなかった。

メラトニン(N-acetyl-5-methoxytryptamine)はウシ松果体より単離されたインドール化合物である。脊椎動物の松果体や網膜におけるメラトニンの合成は,暗期に亢進,明期に抑制され,その結果,血中メラトニン濃度も同様の動態を示すことが報告されてきた。メラトニンはこの日周リズムゆえに環境の光周期に関する情報を伝達するホルモンであると考えられており,哺乳類においては,繁殖期の決定やサーカディアンリズムの同調に重要な役割を果たしていることが知られている。しかしながら,魚類におけるメラトニン動態やメラトニンによる情報伝達機構に関する知見は乏しく,基礎的な知見をさらに積み上げていかなければならない状況にある。そこで,本研究においては,魚類におけるメラトニン合成の調節機構からメラトニン受容体による情報伝達系までを一連のプロセスとしてとらえ,総合的に研究を行った。本研究の概要は以下の通りである。

マイジノールの有効成分6-MBOAはメラトニン合成酵素の活性を高めることが知られています。 【体内サイクルが整う】

魚類における血中メラトニン濃度が日周リズムを示すか否かを明らかにするために,ウグイ,オイカワ,ナマズ,サクラマス,ヒラメ,マダイ,カンパチ,ブリを用いて,明暗条件下における血中メラトニン濃度を測定した。その結果,どの種においても血中メラトニン濃度は暗期に高く,明期に低い日周リズムを示すことが判明した。また,サクラマスとマダイの血中メラトニン濃度におよぼす日長の影響について検討したところ,血中メラトニン濃度の高値持続時間は暗期の長さによって規定されることが明らかになった。これらの結果から,魚類の血中メラトニン濃度は魚種にかかわらず,暗期に高く,明期に低い日周リズムを示すことが明らかになった。

1) ノルアドレナリン合成系の律速酵素阻害剤の前投与がιMSH及び GLP‑1の入眠 ..

キンギョの血中,松果体および眼球内メラトニンの動態について比較検討した。まず,眼球にメラトニンが存在することを高速液体クロマトグラフィーとラジオイムノアッセイの組み合わせにより確認した。次に,明暗条件下における血中メラトニン濃度,松果体および眼球内メラトニン含量を測定したところ,三者とも暗期に高く,明期に低い日周リズムを示すことがわかった。続いて,眼球除去,松果体除去実験を行った結果,血中メラトニン濃度の日周リズムは松果体が作り出していることが確認された。さらに,血中メラトニン濃度と眼球内メラトニン含量の日周リズムにおよぼす日長の影響を検討したところ,キンギョにおいてもメラトニンの高値持続時間は短日条件下の方が長日条件下よりも長いことがわかった。最後に,暗期の開始時から明期を延長して持続性の,また,暗期開始5時間後より急性の光照射(300,1,500lx)を行いその影響について検討した。その結果,持続性光照射により血中メラトニン濃度の日周リズムは失われたが,眼球内メラトニン含量の日周リズムは300lx照射群では振幅が小さくなったものの存続した。一方,急性光照射時には,血中メラトニン濃度は照射開始後直ちに減少し.低い値を維持した。眼球内メラトニン含量は,300lx照射群においては変化を示さなかったが,1,500lx照射群においては照射開始1時間後になってはじめて減少した。急性光照射時の血中メラトニン濃度の経時変化より計算された血中メラトニンの半減期は,300lx照射群においては11.0分,1,500lx照射群においては16.8分であった。以上の結果から,キンギョの松果体と眼球におけるメラトニン合成は互いに独立していること,血中メラトニン濃度の日周リズムは松果体が作り出していること,松果体のメラトニンリズムの方が眼球よりも光感受性が高いことが明らかになった。

反応してメラトニンが分泌される、メラトニンの合成と分泌は 24 時間周期で ..

環境要因がキンギョの血中メラトニン濃度の日周リズムにおよぼす影響について検討するために.季節,水温,および光周期の影響について調べた。まず,自然条件下で季節変化を調べたところ,明期の値は年間を通じて低かったが,暗期の値は季節変化を示し,6月,9月に高く,12月,3月に低い値を示すことが判明した。これらの変化は水温の変化と有意な相関を示したことから,実験的に水温が血中メラトニン濃度の日周リズムにおよぼす影響について,5,15,25℃と水温を変化させて調べた。その結果,光周期にかかわらず,暗期の血中メラトニン濃度は25℃>15℃>5℃の順になった。また,水温にかかわらず,血中メラトニン濃度の高値持続時間は暗期の長さによって規定されていることが判明した。これらの結果から,キンギョの血中メラトニン濃度の日周リズムは環境の光条件と水温の双方に影響を受けた季節変化を示すことが明らかになった。

メラトニンは松果体で分泌されるホルモンであり、アミノ酸のトリプトファンからセロトニンを経由して

キンギョにおけるメラトニンリズムが生物時計による調節を受けているか否かを明らかにするため,恒常条件下でサーカディアンリズム(周期が約24時間の自由継続リズム)を示すかどうか調べた。キンギョにおける血中メラトニン濃度は,恒暗条件下では3日間サーカディアンリズムを示し,明暗条件下の暗期に相当する時刻に高い値を,明期に相当する時刻に低い値を示した。一方,眼球内メラトニン含量は2日間はサーカディアンリズムを示したが,3日目にはリズムは失われた。恒明条件下においては,血中メラトニン濃度は低い値を保ち,変化を示さなかったが,眼球内メラトニン含量は,恒暗条件下に比べて振幅は小さかったものの,サーカディアンリズムを示した。次に松果体の灌流培養を行ったところ,明暗条件下,および逆転した明暗条件下では,メラトニン分泌は暗期に高く,明期に低い日周リズムを示した。恒暗条件下では,周期が23.6ないし24.9時間のサーカディアンリズムを示したが,恒明条件下ではメラトニン分泌は抑制され,リズムは失われた。最後に培養時刻と光条件がキンギョ眼杯標本からのメラトニン分泌量と眼杯におけるメラトニン含量におよぼす影響を検討したところ,明期(1130hr)に眼杯標本を作成し,1200-1500hrの間培養した場合には,メラトニン放出量,メラトニン含量ともに明条件群と暗条件群の間に差は認められなかった。暗期に入る直前(1730hr)に眼杯標本を作成し,1800-2100hrの間培養した場合には,メラトニン放出量,メラトニン含量ともに,暗条件群のほうが明条件群よりも高い値を示した。また,これらの実験の明条件群,暗条件群それぞれにおいて,1800-2100hr培養群の方が,1200-1500hr培養群よりも高い値を示し,培養時刻が眼杯におけるメラトニン産生に影響をおよぼすことが判明した。これらの結果から,キンギョにおけるメラトニンリズムは環境要因のみならず内因性の生物時計による制御も受けていることが明らかになった。

神経系疾患|芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（AADC）欠損症(平成23年度)

メラトニンの作用機序を解明するために,キンギョのメラトニン受容体の分布と性状について検討した。メラトニン受容体の体内分布を2-[¹²⁵I]iodomelatoninをリガンドとしたラジオレセプターアッセイにより検討したところ,脳,網膜に高い特異的結合を,脾臓に低い特異的結合を認めた。脳,網膜における特異的結合は,迅速,安定,可逆的,飽和可能であり,メラトニンに対して高い特異性を示した。親和性(Kd),結合部位数(Bmax)はそれぞれ,脳では27.2±1.4pM,10.99±0.36fmol/mg protein(n＝6),網膜では61.9±5.7pM,6.52±0.79fmol/mg protein(n＝9)であり,生理的なメラトニン受容体であると判定された。細胞内分布を調べたところ,脳では粗マイクロソーム分画(P₃)>粗ミトコンドリア分画(P₂)>粗核分画(P₁),網膜ではP₂>P₃>P₁の順であった。脳内分布を調べたところ,密度は視蓋-視床>視床下部>終脳>小脳>延髄の順であった。これらの結果から,メラトニンは脳内の様々な神経核や網膜に存在するメラトニン受容体に結合して作用している可能性が示唆された。特に視蓋に高密度にメラトニン受容体が分布することから,視覚情報の統合にメラトニンが重要な役割を果たしていると推察される。

メラトニン, 副腎髄質 副腎髄質 甲状腺 松果腺, 血圧上昇，平滑筋収縮/弛緩，肝 ..

メラトニン受容体の細胞内情報伝達系について明らかにする第一歩として,各種グアニンヌクレオチド類とカチオンを用いてG蛋白質と連関しているかどうか調べた。各種ヌクレオチド類はキンギョ脳内メラトニン受容体の特異的結合を用量依存的に減少させた。その効果はguanosine 5’-0-(3-thiotriphosphate)(GTPS)>GTP>GDP>GMP＝ATP>cGMPの順であった。また,GTPS(10^-6M)は,受容体からリガンドの解離を引き起こし,また,メラトニン受容体のKdを増加させ,Bmaxを減少させた。各種無機塩類の影響について調べたところ,NgCl₂(5mM)は特異的結合を増加させたが,高濃度の各種無機塩類は特異的結合を用量依存的に減少させた。その効果はCaCl₂>LiCl>MgCl₂>NaCl>choline chloride＝KClの順であった。MgCl₂(5mM)の存在下ではKdは変化しなかったが,Bmaxは増加した。また,CaCl₂(75mM),MgCl₂(100mM),NaCl(200mM)の存在下においては,Kdは増加し,Bmaxは減少した。これらの結果から,キンギョ脳内メラトニン受容体はG蛋白質と共役していることが示された。

激し、 メラトニンの合成を促し暗期にメラトニンを遊離させる。 ..

メラトニンは明瞭な日周リズムを示すホルモンなので,受容体の側にも日周リズムが存在するのではないかと考え,キンギョ脳内メラトニン受容体の日周リズムとその調節機構について調べた。明暗条件下では,キンギョ脳内メラトニン受容体のBmaxは明期に高く,暗期に低い,血中メラトニン濃度と負の相関を持った日周リズムを示した。この結果から,メラトニン受容体のBmaxがメラトニンによりdown regulationを受けている可能性が示唆されたので,血中メラトニン濃度の日周リズムを消失させる松果体除去と恒明条件下での飼育を行い,その影響について検討した。その結果,松果体除去,恒明条件下での飼育のいずれによっても脳内メラトニン受容体の日周リズムは消失した。また,松果体除去と恒明条件下での飼育の効果は相加的ではなかった。これらの結果から,脳内メラトニン受容体の日周リズムは血中メラトニン濃度の日周リズムにより駆動されていると結論された。

坪井誠二・森山芳則（2005）,「メラトニン合成酵素の構造生物学と概日リズム制御」, 化学と生物, 43巻, 4号, pp.251-256

魚類における血中メラトニンの代謝経路の一端について明らかにするために,メラトニンの代謝器官であると予測されるキンギョの肝膵臓を用いて外因性メラトニンの代謝をin vitroで調べた。その結果,メラトニンは酵素的に6-hydroxymelatoninに代謝されることが判明した。この代謝系は生体内のメラトニン量とその作用を調節する上で重要な役割を果たしていると推察される。